Estudos prévios de isolamento de bactérias são necessários visando posterior seleção e formulação de inoculantes. O trabalho objetivou quantificar bactérias diazotróficas associadas às raízes e folhas de orquídea. Amostras de raízes e folhas foram coletadas de uma planta matriz de Epidendrum secundum da UFV-CAF. O isolamento das bactérias diazotróficas associadas às raízes e folhas foi realizado por meio da técnica do Número Mais Provável usando os diferentes meios de cultura JNFb, NFb, LGI, LGI-P, JMV e JMVL e consultando a tabela McCrady para três repetições por diluição. Os resultados obtidos sofreram transformação logarítmica e depois foram calculadas as médias e o erro padrão da média para cada tratamento. O meio JMVL nas raízes e nas folhas foi o que promoveu o crescimento de uma maior quantidade de bactérias. Concluímos que bactérias diazotróficas habitam naturalmente as raízes e folhas de Epidendrum secundum, com potencial para formulação de inoculantes e biofertilizantes.